2 × Pfu PCR -blanding

A-1 mal

■ Malen inneholder proteinforurensninger eller Taq -hemmere, etc. —— Rens DNA -malen, fjern proteinforurensninger eller ekstraher mal -DNA med rensingssett.

■ Denatureringen av malen er ikke fullført —— Øk denatureringstemperaturen passende og forleng denatureringstiden.

■ Nedbrytning av maler —— Klargjør malen på nytt.

A-2 Primer

■ Dårlig kvalitet på primere —— Syntetiser primeren på nytt.

■ Nedbrytning av primer —— Del væskene med høy konsentrasjon i lite volum for konservering. Unngå å fryse og tine flere ganger eller ved langvarig 4 ° C kryokonservering.

■ Ukorrekt utforming av primere (f.eks. Primerlengde ikke tilstrekkelig, dimer dannet mellom primere, etc.) -Resign primere (unngå dannelse av primer dimer og sekundær struktur)

A-3 mg²⁺konsentrasjon

■ Mg²⁺ konsentrasjonen er for lav —— Riktig økning av Mg²⁺ konsentrasjon: Optimaliser Mg²⁺ konsentrasjon ved en rekke reaksjoner fra 1 mM til 3 mM med et intervall på 0,5 mM for å bestemme den optimale Mg²⁺ konsentrasjon for hver mal og primer.

A-4 Utglødningstemperatur

■ Den høye glødetemperaturen påvirker bindingen av primer og mal. —— Reduser glødetemperaturen og optimaliser tilstanden med en gradient på 2 ° C.

A-5 Forlengelsestid

■ Kort forlengelsestid —— Øk forlengelsestiden.

Fenomener: Negative prøver viser også målsekvensbåndene.

A-1 Forurensning av PCR

■ Kryssforurensning av målsekvens eller forsterkningsprodukter —— Forsiktig å ikke pipette prøven som inneholder målsekvensen i den negative prøven eller søl dem ut av sentrifugerøret. Reagensene eller utstyret bør autoklaveres for å eliminere eksisterende nukleinsyrer, og forekomsten av forurensning bør bestemmes gjennom negative kontrollforsøk.

■ Reagensforurensning —— Alikvoter reagensene og oppbevar ved lav temperatur.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ konsentrasjonen er for lav —— Riktig økning av Mg²⁺ konsentrasjon: Optimaliser Mg²⁺ konsentrasjon ved en rekke reaksjoner fra 1 mM til 3 mM med et intervall på 0,5 mM for å bestemme den optimale Mg²⁺ konsentrasjon for hver mal og primer.

■ Feil primerutforming, og målsekvensen har homologi med ikke-målsekvensen. —— Re-design primere.

Fenomener: PCR-forsterkningsbåndene er uforenlige med den forventede størrelsen, enten store eller små, eller noen ganger oppstår både spesifikke forsterkningsbånd og uspesifikke forsterkningsbånd.

A-1 Primer

■ Dårlig primerspesifisitet

—— Re-design primer.

■ Grunnkonsentrasjonen er for høy —— Øk denatureringstemperaturen riktig og forleng denatureringstiden.

A-2 mg²⁺ konsentrasjon

■ Mg²⁺ konsentrasjonen er for høy —— Reduser Mg2+ -konsentrasjonen riktig: Optimaliser Mg²⁺ konsentrasjon ved en rekke reaksjoner fra 1 mM til 3 mM med et intervall på 0,5 mM for å bestemme den optimale Mg²⁺ konsentrasjon for hver mal og primer.

A-3 termostabil polymerase

■ Overdreven enzymmengde —— Reduser enzymmengden på passende måte med intervaller på 0,5 U.

A-4 Utglødningstemperatur

■ Glødningstemperaturen er for lav —— Øk glødetemperaturen på riktig måte, eller bruk to-trinns glødemetode

A-5 PCR-sykluser

■ For mange PCR -sykluser —— Reduser antallet PCR -sykluser.

A-1 Primer——Dårlig spesifisitet ——Resign primeren, endre posisjonen og lengden på primeren for å forbedre dens spesifisitet; eller utføre nestet PCR.

A-2 Mal-DNA

——Malen er ikke ren —— Rens malen eller ekstraher DNA med rensesett.

A-3 mg²⁺ konsentrasjon

——Mg²⁺ konsentrasjonen er for høy —— Reduser Mg riktig²⁺ konsentrasjon: Optimaliser Mg²⁺ konsentrasjon ved en rekke reaksjoner fra 1 mM til 3 mM med et intervall på 0,5 mM for å bestemme den optimale Mg²⁺ konsentrasjon for hver mal og primer.

A-4 dNTP

—— Konsentrasjonen av dNTP er for høy —— Reduser konsentrasjonen av dNTP på riktig måte

A-5 Utglødningstemperatur

—— For lav glødetemperatur —— Øk glødetemperaturen passende

A-6 sykluser

—— For mange sykluser —— Optimaliser syklusnummeret

Det første trinnet er å velge riktig polymerase. Vanlig Taq-polymerase kan ikke korrekturleses på grunn av mangel på 3'-5 'eksonukleaseaktivitet, og mismatch vil i stor grad redusere forlengelseseffektiviteten til fragmenter. Derfor kan vanlig Taq -polymerase ikke effektivt amplifisere målfragmenter større enn 5 kb. Taq -polymerase med spesiell modifikasjon eller annen high fidelity -polymerase bør velges for å forbedre forlengelseseffektiviteten og dekke behovene til lang fragmentforsterkning. I tillegg krever forsterkningen av lange fragmenter også tilsvarende justering av primerdesign, denatureringstid, forlengelsestid, buffer-pH, etc. Vanligvis kan primere med 18-24 bp føre til bedre utbytte. For å forhindre malskade, bør denatureringstiden ved 94 ° C reduseres til 30 sekunder eller mindre per syklus, og tiden for å stige temperaturen til 94 ° C før forsterkning bør være mindre enn 1 min. Videre kan innstilling av forlengelsestemperaturen til omtrent 68 ° C og utforming av forlengelsestiden i henhold til hastigheten på 1 kb/min sikre effektiv forsterkning av lange fragmenter.

Feilraten for PCR -forsterkning kan reduseres ved å bruke forskjellige DNA -polymeraser med høy kvalitet. Blant alle Taq DNA -polymerasene som er funnet så langt, har Pfu -enzymet den laveste feilraten og den høyeste troverdigheten (se vedlagte tabell). I tillegg til enzymvalg kan forskere ytterligere redusere PCR -mutasjonshastigheten ved å optimalisere reaksjonsbetingelsene, inkludert optimalisering av buffersammensetning, konsentrasjon av termostabil polymerase og optimalisering av PCR -syklusnummer.